一、目的 学会叶绿体色素提取和分离的方法，了解叶绿体色素的性质。 二、材料用具及仪器药品（1） 层析液配方：石油醚20ml+丙酮2ml+苯1ml（2）天平、研钵、烧杯、量筒、滤纸、表面皿、剪刀、90-95%乙醇、汽油、漏斗、滴管（3）菠菜、木茨等叶子 三、原理叶绿体含有叶绿体色素，叶绿体色素主要包括有Chla、Chlb、叶黄素和胡萝卜素，可用有机溶剂乙醇、丙酮等将它们提取出来。纸层析法是分离叶绿体色素最简单的方法。它的原理是利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，分别以不同程度分布于两相中（即固定相和流动相）。由于它们以不同的速度移动，从而达到分离的目的。 叶绿体色素容易受光的破坏，变成褐色。叶绿体色素具有荧光现象。叶绿素分子的镁可被铜替代，形成铜代叶绿素。叶绿体色素对不同波长的光具有吸收作用。 四、方法 1、纸层析法分离叶绿体色素（方法1）（1） 称取新鲜叶片（木茨、菜心、菠菜等叶均可）1克，剪碎，放在研钵中，加乙醇5m1，共研磨成匀浆，静置5分钟。（2） 用滴管吸取上面的色素提取液4～5滴。一滴一滴地滴在滤纸的中央（滤纸要平放在表面皿或培养皿上）。待色素点风干后，向该色素点上慢慢滴加汽油，使四种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）在滤纸上分离出来，四种色素在滤纸上的移动速度是胡萝卜素（橙黄色）>叶黄素（黄色）>叶绿素a(蓝绿色)>叶绿素b（黄绿色）。 2、纸层析法分离叶绿体色素（方法2） （1） 称2克新鲜绿色叶片，剪碎，放在研钵中，加入5ml乙醇，共研磨成匀浆，过滤，该滤液即为色素提取液。（2）取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将它剪成长约10cm ，宽约1cm的滤纸条。（3）用毛细管吸取色素提取液。在滤纸条的一端（约距这一端的1cm处）划出一条滤液细线，等滤液干燥后，再重复划4～5次。（4）将滤纸条的另一端（约距这一端1cm处）拆成“V”字形，并将它挂在放有层析液的烧杯壁上（注意：色素线要略高于层析液面，且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁），盖上培养皿。（5）经几分钟后，观察色素带的分布，最上端为胡萝卜素，其次是叶黄素，再次是叶绿素a，最后是叶绿素b。3、叶绿体色素的性质鉴定（1）叶绿体色素的提取取菠菜（或其他植物）叶子2g，加石英砂和碳酸钙少许，乙醇约5ml，研磨成匀浆，再加乙醇15ml，用漏斗过滤，即为色素提取液。（2）叶绿素的荧光现象取上述色素乙醇提取液少许于试管中，在反射光和透射光下观察色素提取液的颜色有什么不同。反射光下观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光现象。（3）光对叶绿素的破坏作用取上述色素乙醇提取液少许，分装在2支试管中，1支试管放在暗处（或用黑纸包裹），另1支试管放在强光下（太阳光），经2—3小时后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同？（4）铜在叶绿素分子中的替代作用取上述色素乙醇提取液少许于试管中，1滴1滴地加入盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体1小粒，慢慢地在酒精灯上加热溶液，使溶液又产生亮绿色，此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。（5）黄色素和绿色素的分离将叶绿体色素的酒精提取液10毫升倒入分液漏斗中，倾斜漏斗，并沿其壁慢慢加入15毫升汽油（或乙醚），轻轻摇动5分钟，静置片刻后，溶液即分为两层，上层为绿色的汽油层，主要含有叶绿素。为使色素分离完全，从分液漏斗放出下层酒精溶液，将之盛于干燥的试管（A）中，再往留在分液漏斗中的汽油层色素溶液加入95%酒精5ml，轻轻摇动之，弃去下层黄色溶液，并将上层绿色的叶绿素汽油层提取液放入试管（B）中，用棉花塞住试管口。同样将试管（A）所盛的黄色酒精溶液倒入分液漏斗中，加入汽油5ml，轻轻摇动分液漏斗，将下层黄色溶液放入试管（C）中，塞以棉花。最后用分光镜观察绿色溶液和黄色溶液的吸收光谱。（6）黄色和绿色溶液的吸收光谱的观察用手持分光镜观察黄色溶液和绿色溶液的吸收光谱。五、实验报告 1、将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上，并给予分析。2、解释叶绿体色素的光学性质。