柱层析技术的操作方法主要包括常压分离、减压分离和加压分离三种。常压分离简单但洗脱时间较长，而减压分离能节省填料但可能因空气导致溶剂挥发和水汽凝结，且对易分解化合物处理困难，需要额外设备。加压分离则能加快淋洗剂流动，缩短洗脱时间，是常用的有效方法，通过外加压力提高淋洗效率。

柱子规格的选择根据样品特性和含量决定。长柱子可提供更高塔板数，分离效果更好。通常柱径与高度的比例在1:5到1:10之间。对于分离度要求高的样本，可以选择内径较小的柱子，如2cm×20cm；若需较大分离度，则应选择更长的柱子。

柱层析色谱柱的填装分为湿法和干法。湿法需用淋洗剂溶解样品，但需控制溶剂量，避免溶剂成为主要淋洗剂。柱底活塞应避免涂润滑剂，使用聚四氟乙烯材料的阀门。干法与湿法填装无本质区别，关键是柱子填充要均匀且适度紧密，避免气泡和柱体开裂。

溶剂的选择是柱层析的关键，需考虑溶解性、亲合性和分离度。常用的有石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等。注意正己烷价格高，乙醚易挥发，二氯甲烷和甲醇可能产生气泡。对于痕量分析，淋洗剂需高纯度，且过柱后要回收以环保和节省成本。

上样时，先用少量溶剂溶解样品，然后逐步加低极性溶剂，确保石英砂层为白色。上柱前需避免样品粘性过大导致析出。对于溶解性差的样品，可能需要干法上柱。

淋洗液收集后，由于大量溶剂，需要浓缩，对于挥发性物质，常压挥发溶剂更合适，以防止检测结果偏低。

扩展资料

柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。