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实验室一般如何定量提取植物基因组DNA的浓度
时间:2024-12-23 15:30:01
答案

实验方法原理 幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段,细胞核较大而细胞质较少,核酸浓度高,且内含物少,次生代谢产物少,蛋白质及多糖类物质相对较少,在SDS或CTAB物质存在时,经机械研磨,使细胞破裂释放出内含物,提取的DNA、RNA的产量高,纯度好。提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活Dnase。DNA定量分析可采用紫外光谱分析法。原理是DNA分子在260nm处有特异的紫外吸收峰,且吸收强度与DNA的浓度成正比。此外,还可以通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA带的亮度来分析,因为EB作为一种荧光染料,能插入DNA的碱基对平面之间而结合于其上,在紫外光的激发下产生荧光,DNA分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。

实验内容和实验步骤

1.提取DNA

(1)提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要在高压灭菌锅中121℃(约1.1 kg/cm2)高压灭菌20 min。

(2)用液氮将50mg 幼嫩叶片研磨成细粉,置于1.5ml 离心管中加入预热至65℃的600μl 的CTAB提取液,轻摇混匀。

(3)65℃水浴1小时,其间轻摇混匀。

(4)12000rpm离心10min,取上清转移至另一1.5ml 离心管中。

(5)向上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻混匀10min,然后12000rpm离心10min,再转移上清入新管。

(6)向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),轻轻混匀10min,然后12000rpm离心10min,再转移上清入新管。

(7)向上清液中加1/10体积的3M NaAC (pH5.2),等体积的冷异丙醇,小心混匀。12000rpm离心10min,弃上清。

(8)用70%乙醇洗涤沉淀一次,12000rpm离心,弃上清。

(10)将沉淀在超净工作台上吹干,加50μl TE (pH8.0)室温溶解。

电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量。

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