电生理常规技术 电生理常规技术 一．电刺激。 二．生物放大器：正确选择，植物性神经冲动幅度多为50-100μV。不同组织，应采用不同的参 数。如 ECG：振幅0.1-2mV, 灵敏度0.5-1mV，时间常数0.1-1.0s，高频滤波1KHz 植物性神经冲动：振幅50-150μV, 灵敏度25-100μV，时间常数0.01-0.1s，高频滤波3-5KHz 中枢神经元单位放电：振幅100-300μV, 灵敏度50-100μV，时间常数0.01-0.1s，高频滤波5-10KHz 三．玻璃微电极： 常用尖端0.5-5μm，向细胞内插入时，需小于0.5μm（细胞直径的1/10~1/100），且尖端的倾斜度应相当缓和，一般微电极可分为金属微电极和玻璃微电极两类。 金属微电极，现多用镀铂钨丝电极（platinum-plated tungsten electrode），在钨丝上镀铂，可极大改善电极的电学特性，噪声可大大降低，加之机械强度大，适合长期体外记录（paré D， Gaudreau H. Projection cells and interneurons of the lateral and basolateral amygdala: distinct firing patterns and differential relation to the thera and delta rhythms in conscious cats. J Neursci, 1996,16(10):3334-3350 现要也常用镀银碳纤维电极。玻璃微电极记录易受机械位移的影响，加之尖端的电解质会漏出或堵塞，不适合半小时以上的长时间记录，玻璃微电极可分单管和多管微电极。 毛坯管在国外多用Pyrex管，国内多用GG-17和95料玻管。细胞外记录多采用外径1.5-2mm玻璃，细胞内记录则采用外径1mm细玻管，内外径之比约为2：3或5：6，长6-8cm。拉制前必须经过清洁处理。 清洁液：用等量的（250ml）王水（可反复应用）。一般毛坯管捆成把放入清洁液中1-2h，取出自来水冲洗20-30min，再放入无水酒精中洗 涤，再放入盛满蒸馏水烧杯中加热煮沸10min，倒去蒸馏水，再换新蒸馏水反复3次，再放入烤箱中烤干，备用，切不可用市售的洗涤剂，以防降低电极充灌液的表面张力而影响冲灌。 充灌液常用3mol/L KCl，为避免Cl-扩散，也可用2mol/L醋酸钾或柠檬酸钾充灌，也有人用0.5-1mol/L NaCl（低浓度）充灌可降低噪音。细胞外记录时，最后再用3-4mol/L NaCl +2%旁胺天蓝溶液定位。在膜片钳中还常加钙螯合剂，如EGTA。 阻抗与不同组织相关。 四．电生理实验中噪声和干扰的形成和排除。 （一）来源。 1．干扰信号与生物电生理信号的鉴别。准确区分生物电信号与干扰的伪迹是电生理实验的先决条件。 2．来源。主要有三个方面： 其一。物理性干扰。1）静电和电磁的干扰：实验室附近高压电，室内日光灯可产生50Hz的静电干扰，尤其是交流电，尤其是50Hz频率干扰最大（电子设备为50Hz）。其特点是幅度大，波形规则。2）噪声干扰：电子元件本身产生杂乱无章电压和电流称噪声，一般与放大器内部元件的质量与性能有关。 其二。接地不良。1）地线电阻应小。2）仪器故障。产生漏电电流，在地线上形成电位差，产生干扰。3）地线行走过程中打圈，形成线圈，易接受电场和磁场的干扰。4）各仪器设备应采用一点接地的方式，若采用多点接地，形成大地回路，也会引起干扰。5）地线过长与电源线形成交流环路。6）误用市电三孔中性线作为大地线（中性线上有4-5A电流）。 其三。生理性干扰。1）大脑电活动时，眨眼、眼球运动均对脑电具有干扰作用。2）实验中环境温度过低，动物寒战、抖动，引起肌电的发放而干扰记录，或因呼吸运动引起记录部位机械位移引起干扰信号。3）心电干扰，频率与心电一致。 （二）排除。 1．物理性干扰。1）屏蔽法：用于低频电和静电干扰，屏蔽线分布电容较大，线与线之间不可平行排列，更不可为了美观而将多线扎在一起，这会加大分布电容，易偶合高频干扰噪声。2）远离法。3）改变位置法。依电流方向相反，产生反向磁场的原理，改变各个仪器的位置或放大器输入的方位，会使干扰磁场抵消，微电极放大器探头阻抗高，易引入干扰，实验前可反复调整其方向和位置。4）微电极记录时尽量减少微电极本身的阻抗，减少输入阻抗及干扰信号在这个阻抗上形成干扰电压降，微电极到探头的连线<5cm。5）用监听器监听噪声，以便及时排除。 2．仪器质量，尽量改进。 3．接地不良。地线应尽量短粗，不能与电源线平行或打圈，不 要接在电源线的中性线 上，地线单独埋设，埋置处应较潮湿，附近无大型变压电动机，并在坑内加些食盐。 4．检查各仪器 是否漏电。 5．慢生物电变化时用乏极化电极，实验对象宜安静，勿受振动。 （三）刺激伪迹过大及防止。1）尽量减少刺激脉冲的波宽和强度。2）在动物体或标本上，尽量延长刺激部位 的距离，在刺激电极 和引导电极之间加一接地电极，此电极离引导电极愈近，刺激伪迹就越小；采用变换刺激极性，结合叠加处理，可抵消伪迹。 注：微电极中高浓度充灌液易蒸发，造成电极回路的开路，因此常在微电极插入Ag-AgCl丝或铂金丝后，在微电极尾部开口处涂上一层凡士林，防止水分蒸发。 动物麻醉和制动下，体温会下降，故应保温调节，加温维持肛温36-38℃. 记录脊髓背角或腹角神经元将脊柱前后拉直以减小呼吸运动造成的位移。记录脑神经元应在表面用温热石蜡制成一油槽，防止血管博动和呼吸运动的影响。 五．细胞内微电极记录 多用幼年离体标本，其原因：1）幼年动物骨骼骨化不完全，结缔组织少，神经组织易于分离，标本耐缺氧能力强，有的标本可存活数小时至数天，但标本也可能发育不完全，如背根和脑干到脊髓的投射纤维要到三周动物才完全。神经纤维髓鞘化不全，其药理作用与成年动物也不同。从实验角度上讲，脊髓背腹根短，不利于电生理刺激记录。小鼠一般应小于15g，制备标本才 有可能成功，而这样小鼠背腹根神经节不利于电生理实验。最适合的动物是金黄地鼠（hamster），介于大小鼠之间，制备标本活性很好，可能与其冬眠习性有关，而且其脊髓背腹根长达20-25mm，利于电生理记录。动物选择仍依实验而定，同一标本，不同中枢结构对缺氧耐受力也不同。金黄地鼠，若观察脊髓背角神经元活动，可用150-160g体重的鼠均可，但要研究腹角神经元，则体重不宜超过30g。 离体标本的灌流注，如ACSF。其中缓冲液成分有两种，一是重碳酸盐（bicarbonate）：温度低（4℃），配方有利于降低组织兴奋性。二是磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液：其优点是接近于 人体环境。各种缓冲液一般都先配母液，临用前一天，或临用前稀释。